Bakterite kasvatamine: meetodid, põhimõtted, sammud ja tingimused

2024 Autor: Angel Austin | [email protected]. Viimati modifitseeritud: 2023-12-17 05:24

Meid ümbritsevas looduses leidub mikroorganisme kõikjal: pinnases, veekogudes, erinevate objektide pindadel on nendega asustatud inimesi ja loomi. Kõik see võib olla toidu, ravimite ja tootmisliinide mikroobse saastumise allikaks. Bakterite kasvatamine on vajalik nende omaduste, vajaduste ja omaduste uurimiseks. See on omakorda oluline samm erinevate ravimite väljatöötamisel, haiguste laboratoorsel diagnoosimisel, tootmisreaktorite arvutamisel ja paljus muus.

Üldmõisted

Bakterite kultiveerimine mikrobioloogias tähendab mikroorganismide kultiveerimist laboris. Valitud toitekeskkonnal kasvanud mikroobe nimetatakse omakorda kultuuriks. Kultuure saab segada, kui neid moodustavad erinevat tüüpi mikroorganismid, ja puhtaid, kui neid esindavad ainult ühte tüüpi bakterid.

Kui toitumisalaneSöötmesse asetatakse ainult üks rakk ja selle paljunemise tulemusena saadakse isendite rühm, siis nimetatakse seda mikroorganismide kogumit klooniks. Kui kloon areneb punktini, kus see muutub palja silmaga nähtavaks, nimetatakse seda bakterite kogumit kolooniaks.

Tavaliselt kultiveeritakse erinevatest allikatest eraldatud baktereid üksteisest eraldi. Iga sellist eraldi kasvatatud mikroobide rühma nimetatakse tüveks. Seega, kui ühte tüüpi stafülokokk isoleeritakse kolmest allikast (või sama toote erinevatest osadest, erinevatest inimestest), räägitakse seda tüüpi stafülokokkide kolmest tüvest.

Bakterite kasvufaktorid

Nende hulka kuuluvad erinevad aminohapped, lipiidid, puriinalused ja muud mikroorganismide arenguks vajalikud ühendid. Mõned mikroobid suudavad iseseisv alt toota vajalikke aineid, teised aga peavad need valmis kujul vastu võtma. Vastav alt mikroorganismide vajadustele teatud kasvufaktorites viiakse läbi bakterite identifitseerimine ja diferentseerimine. Samuti on see parameeter oluline toitekeskkonna õigeks ettevalmistamiseks labori- ja biotehnoloogiliseks tööks:

• Aminohapped. Bakterid võivad vajada ühte kindlat aminohapet või hapete rühma. Niisiis vajavad klostriidid leutsiini ja türosiini, streptokokid aga leutsiini ja arginiini. Mikroorganisme, mis vajavad kasvamiseks väljastpoolt pärit aminohappeid, nimetatakse auksotroofideks.
• Puriin- ja pürimidiinialused, samuti nende derivaadid (adeniin, guaniin jt). Need on paljude kasvu jaoks olulised teguridStreptokoki liigid.
• vitamiinid. Need on osa koensüümidest, mida bakterid vajavad. Niisiis vajavad difteeria ja shigella corynebacteria nikotiinhapet ja selle amiidi, mis on osa NAD-st ja NADP-st. Tiamiini kui pürofosfaadi lahutamatut osa vajavad Staphylococcus aureus, pneumokokk, brutsella. Pantoteenhapet, mis on osa CoA koensüümist, vajavad teetanuse batsillid ja teatud tüüpi streptokokid. Tsütokroomid ja seega ka foolhape, heemid ja biotiin, mis neid moodustavad, on vajalikud Mycobacterium tuberculosis'e ja Haemophilus influenzae jaoks.

Keskkonnanõuded

Tingimused bakterite kasvatamiseks kasutatava söötme jaoks:

1. Toitumine. Need peavad sisaldama aineid, pealegi kergesti seeditaval kujul, mis on vajalikud mikroorganismide toitmiseks ja energiavarude taastamiseks. Nende hulka kuuluvad organogeenid ja mineraalid. Mõned mikroorganismid vajavad lisaks vitamiine ja aminohappeid, mida nad ei saa sünteesida.
2. Optimaalne pH tase. See mõjutab rakumembraani läbilaskvust ja vastav alt ka võimet omastada toitaineid bakteri poolt. Enamasti peaks pH väärtus olema vahemikus 7, 2–7, 4. Paljud mikroorganismid toodavad oma eluea jooksul happelise või aluselise reaktsiooniga tooteid ning et toitekeskkonna pH ei muutuks, see peab olema puhverdatud.
3. Isotooniline. Bakterite kasvatamise toitainekeskkonna osmootsel rõhul peaksid olema samad väärtused kuimikroobirakkude sees. Tavaliselt vastab see 0,5% NaCl lahusele.
4. Steriilsus. See on tingitud asjaolust, et võõrbakterite ilmumine moonutab analüüsitud tüve uurimise tulemusi.
5. Niiskustase. Sellel indikaatoril koos söötme konsistentsiga peaksid olema teatud tüüpi bakterite jaoks optimaalsed omadused.
6. Redoksipotentsiaal (RH2). See näitab elektrone loovutavate ja vastuvõtvate ainete suhet, samuti toitainekeskkonna hapnikuküllastuse taset. Aeroobide ja anaeroobide puhul erinevad bakterite kasvatamise tingimused selle näitaja osas mõnevõrra. Anaeroobsed mikroorganismid paljunevad kõige paremini RH2 väärtustel alla 5 ja aeroobsed mikroorganismid vähem alt 10.
7. Ühtlus. On oluline, et sööde sisaldaks konstantses koguses üksikuid koostisosi. Lisaks eelistatakse selgeid lahendusi, mis hõlbustavad põllukultuuride kasvu jälgimist või saastumist.

Kultuurisöötme tüübid

Mikroorganismide kasvatamiseks konkreetse söötme valikut mõjutavad paljud tegurid, sealhulgas nende toitumise omadused ja uuringu eesmärk. Toitekeskkonna klassifitseerimise põhijooned on järgmised:

1. Komponendid. Substraadi loomisel kasutatud algainete järgi eristatakse:

• looduslikud, mis on valmistatud loomse või taimse päritoluga saadustest (nt liha, piim, puuvili) ja sobivad kasvatamiseks segatunapõllukultuurid;
• poolsünteetiline, milles kallid looduslikud toiduained asendatakse toiduks mittekasutatavate toodetega (näiteks kondijahu, verehüübed) ja mis on optimaalsed teatud tüüpi bakterite kultiveerimiseks või nende ainevahetusproduktide isoleerimiseks keskkond;
• sünteetilised, mis valmistatakse täpses koguses keemilistest ühenditest, on teadaoleva püsiva koostisega ja kergesti reprodutseeritavad.

2. Konsistents (tihedus). Eristage keskkondi:

• vedelik;
• tihe;
• poolvedel.

Viimased kaks valmistatakse spetsiaalsetest lahustest või vedelatest ainetest, millele on lisatud agar-agarit või želatiini, et luua vajalik tihedus. Lisaks on tihe keskkond bakterite kasvuks hüübinud vereseerum, kartul, silikageeli sööde, karrageen.

3. Ühend. Selle põhjal on keskkonnad:

• lihtne, mille loetelu on lühike: lihapeptoonpuljong (MBB), Hottingeri puljong ja agar, lihapeptoonagar (MPA), toitaineželatiin ja peptoonvesi.
• kompleks, valmistatud lihtsatest, millele on lisatud verd, vadakut, süsivesikuid ja muid aineid.

4. Kohtumine. Eristatakse järgmisi toitainekeskkondi:

• peamisi kasutatakse paljude patogeensete mikroobide kasvatamiseks (tavaliselt lihtsa koostisega);
• spetsiaalseid kasutatakse bakterite isoleerimiseks ja kultiveerimiseks, mis ei kasva lihtsatel substraatidel;
• selektiivsed (nad on ka selektiivsed) sobivad teatud tüüpi bakterite isoleerimiseks ja nendega seotud mikroobide kasvu pärssimiseks (selektiivsusloodud söötmele teatud ainete, näiteks antibiootikumide või soolade lisamisel või pH reguleerimisel);
• diferentsiaaldiagnostika võimaldab eristada ühte tüüpi baktereid teisest, hinnates näiteks söötme ensümaatilist aktiivsust;
• säilitusaineid on vaja esialgsel inokuleerimisel ja järgneval proovide transportimisel, kuna need hoiavad ära mikroorganismide surma ja pärsivad ka teiste bakterite kasvu.

Meedia ettevalmistus

Kõige olulisem samm anaeroobsete bakterite kasvatamisel on sobiva toitekeskkonna valmistamine. Pärast optimaalsete parameetrite valimist jätkake järgmiste etappidega:

• kaalumine, valides analüütilisel kaalul komponentide näidise;
• lahustatakse 70 °C-ni kuumutatud destilleeritud vees ning fosfaadid, mikro- ja makrosoolad lahustatakse eraldi;
• kaks minutit veevannis keetmine;
• pH määramine indikaatorpaberi või potentsiomeetriga;
• filtreerimine läbi märja riide või paberfiltrite nii vedela kui ka sulatatud tiheda söötme jaoks ja läbi puuvillase marli filtri agarsöötme jaoks;
• villimine teostatud 3/4 mahuga;
• keskmisest sõltuv steriliseerimine;
• steriilsuse kontroll viiakse läbi kaheks päevaks termostaadis seismisega, millele järgneb vaatamine;
• keemiline kontroll pH ja vajaliku sisalduse kindlakstegemiseksüksused;
• bioloogiline kontroll katseinokuleerimisega.

Klaasnõude ja kandja steriliseerimine

Üks bakterite kasvatamise põhiprintsiipe on steriilsus. Võõr mikroorganismide kasv ja areng võib mõjutada toitekeskkonna omadusi, muutes selle keemilist koostist ja pH-d. Steriliseerimine on puhaskultuuride kasvatamise peamine tingimus. Praktikas tähendab see mõiste absoluutselt kõigi eluvormide hävitamise meetodeid steriliseeritud esemete pinnal ja mahus. Anumad, kasutatud instrumendid, söötmed ja muud uuringu ajal kasutatud esemed steriliseeritakse.

Mõned steriliseerimisviisid:

• Süüde. Aasade ja nõelte steriliseerimine külvamiseks, klaasklaasid, mõningaid instrumente saab teostada põleti või piirituslambi abil.
• Keeb. Sobib süstalde, nõelte, toidu käsitsemiseks, kuid ei tapa bakterite eoseid.
• Kuivsteriliseerimine. Seda tehakse spetsiaalses kuivatuskapis ja see sobib kolbide, katseklaaside ja muude laboriklaaside töötlemiseks.
• Auruga steriliseerimine. See autoklaavis läbi viidud meetod on väga tõhus. Kuid see ei sobi toitainekeskkonda, mis sisaldab valke või muid kõrgel temperatuuril lagunevaid ühendeid. Säästlikumat võib nimetada tündaliseerimiseks. Seda tehakse Kochi katlas ja see ühendab eoste idanemise nende hävitamisega.
• Pastöriseerimine. Seda kasutatakse söötmete jaoks, mis muudavad keetmisel oma omadusi (näiteks piim, vein, õlu), mis on võimelisedvabastada need eoseid mittekandvatest mikroorganismidest. Töötlemistemperatuur on ainult 50-60 ° C viisteist kuni kolmkümmend minutit. Mõnel juhul kasutatakse külmsteriliseerimist filtrite või UV-kiirte abil.

Bakterite kasvatamise tingimused

Bakterite kasv ja areng on võimalik ainult teatud tegurite ja nende väärtuste korral:

1. Temperatuur. Seal on kolm bakterirühma, mis erinevad temperatuurieelistuste poolest:

• termofiilid ehk soojust armastavad mikroobid kasvavad temperatuuril 45–90°C, mis tähendab, et nad ei paljune inim- ega loomaorganismides;
• psührofiilid ehk külmalembesed mikroorganismid eelistavad temperatuuri vahemikus 5–15 °C ja neid kasvatatakse külmhoonetes;
• mesofiilid arenevad temperatuuril 25–37 °C, nende hulka kuulub suurem osa baktereid.

2. Valgus. See on fototroofsete bakterite kasvatamise tunnus, kuna nad viivad läbi fotosünteesiprotsessi. Kuid enamiku mikroobide jaoks ei ole valgustus eeltingimus. Ja isegi vastupidi, päikese ultraviolettkiirgus võib nende arengut pärssida.

3. Vesi. Kõik mikroorganismid vajavad vett ligipääsetaval (vedelal) kujul. Seetõttu ei kasva külmutatud toidus bakterid vähe või üldse mitte.

4. Keskkonna happesus. Seda bakterite kasvatamise põhimõtet on juba eespool üksikasjalikult käsitletud.

5. Õhustamine. Hapnik kui keemiline element on vee ja paljude selleks kasutatavate ühendite lahutamatu osamikroorganismide kasvatamine. Gaasiline hapnik võib sisalduda ka vees ja muudes vedelikes lahustunud kujul. Märkimisväärne osa bakteritest vajab pidevat hapnikumolekulide varustamist. Kuid paljude mikroorganismide jaoks on see tarbetu või, mis veelgi hullem, gaasiline hapnik on neile mürgine, kuna neil pole katalaasi ja peroksidaasi, mis hävitavad mürgiseid hingamisteede tooteid. Seetõttu on anaeroobsete bakterite kasvatamise kõige olulisem samm O₂ molekulide eemaldamine toitainekeskkonnast.

6. Mikroorganismide kasvatamine. Aeroobsete ja anaeroobsete bakterite kasvatamine toimub erinevates keskkonnakihtides ja erinevatel režiimidel.

Aeroobsete mikroorganismide kasvatamine

Aeroobsete bakterite kasvatamiseks on vaja molekulaarset hapnikku. Aeroobide puhaste kultuuride saamiseks, mida saab eduk alt kasutada meditsiinis ja toiduainetööstuses, kasutatakse järgmisi meetodeid:

• pind kasvab tihedal söötmel või vedelas keskkonnas (nende õhuke kiht), kui hapnik tuleb otse õhust;
• sügav kasvatamine vedelas keskkonnas, kui neis lahustunud hapniku koguse suurenemine saavutatakse pideva õhutamisega.

Anaeroobsete mikroorganismide kasvatamine

Seda tüüpi bakterite kasvatamise põhiprintsiip on nende minimaalne kokkupuude õhuhapnikuga. Nende kasvutingimuste loomine on palju keerulisem kui aeroobide jaoks. Anaeroobide eraldamiseks molekulaarsest O₂:

kasutatakse järgmisi meetodeid.

1. Füüsiline. See anaeroobsete bakterite kasvatamise meetod taandub nende kasvatamisele spetsiaalses vaakumseadmes - mikroanaerostaadis. Õhk selles asendatakse spetsiaalse lämmastiku gaasiseguga, millele on lisatud 10% vesinikku ja 5% süsinikdioksiidi.
2. Keemiline. Nende hulka kuuluvad: absorbeerivate ainete kasutamine (nt Fe, Na₂S₂O₄, CuCl) või redutseerivad ained (nagu askorbiinhape).
3. Bioloogiline. See taandub aeroobide ja anaeroobide kooskasvatamisele suletud süsteemis. See bakterite kasvatamise meetod hõlmab ühe poole Petri tassi külvamist mõne aeroobse bakteriliigiga ja teise poole uuritud anaeroobiga. Selle arendamine algab hetkel, kui kogu hapnik on ära kasutatud.

Anaeroobsete bakterite kasvatamiseks sobivad järgmised külvimeetodid:

• pinnakihis;
• steriilse parafiiniga täidetud pinnakihis;
• tiheda toitainekeskkonna paksuses;
• viskoosse kandja sügavates kihtides.

Puhta kultuuri omandamine

Mikrobioloogid töötavad tavaliselt proovidega, milles on palju erinevat tüüpi mikroobe. Mikroorganismide (sugukond, perekond, liik) süstemaatilise asukoha kindlaksmääramiseks, aga ka nende omaduste uurimiseks on vaja need isoleerida ja kasvatada puhaskultuuri. Neil on suur tähtsus paljudes toiduainetööstuses, näiteks juustu, leiva, kalja, veini jne tööstuses. Piimhappebakterite kasvatamine võimaldab saadaoluline komponent kääritatud piimatoodete, taigna, kakao, silo ja isegi plasti tootmisel.

Tihedas söötmes puhta kultuuri isoleerimise meetod põhineb mikroorganismide rakkude mehaanilisel eraldamisel ja nende järgneval isoleerimisel. Proov viiakse steriilsesse vette või soolalahusesse (maht 10-100 ml) ja seejärel loksutatakse kaks minutit. Uuritava materjali paksuses paiknevate mikroorganismide (näiteks vorstid või juust) eraldamiseks tehakse esm alt proovitükkide hõõrumine steriilsete instrumentidega liivaga. Eeltöötlemise läbinud materjali, mis kaalub 1 g või maht 1 ml, lahjendatakse steriilse veega 10, 100, 1000 jne korda. Valitakse selline lahjendusaste, mis annab rakkude kontsentratsiooni, mis vastab meetodi võimalustele.

Mikroorganismide edasine kasvatamine on toitekeskkonna ettevalmistamine. Tavaliselt valitakse tihe keskkond (MPA). Esm alt sulatatakse ja jahutatakse temperatuurini 45-50 °C ning alles seejärel valatakse mitmesse Petri tassi (kolm kuni viis tükki), mille põhjale asetatakse erineva kontsentratsiooniga tampoonid uuritavast ainest. Järgmisena segatakse veel külmutamata toitainekeskkond ja sinna sisestatud materjal. Nii fikseeritakse rakud substraadi ruumala erinevates punktides.

Järgmisena asetatakse Petri tassid 2 päevaks 22 °C juures termostaadi. Selle aja jooksul paljunevad rakud sedavõrd, et iga raku moodustatud koloonia muutub palja silmaga nähtavaks. Igaüks neist on seda tüüpi bakterite puhaskultuur, mille rakkudest see on päritroos.

Pärast seda subkultuuritakse mikroorganismid Petri tassidel eraldi katseklaasidesse, mis on täidetud toitainekeskkonnaga. Sel viisil eraldatakse segaproovist puhaskultuurid. See meetod kannab selle arendaja nime - R. Koch. Tavaliselt nimetatakse seda ka topsimeetodiks ehk kurnavaks külviks. Pärast erinevat tüüpi bakterite puhaskultuuride saamist määratakse nende kuju, eosed ja perekonnad.

Kõik tööd tuleb teha vastav alt aseptika põhimõtetele. Mikroorganismide enneaegse arengu vältimiseks tuleks uuring läbi viia kohe pärast proovide võtmist. Kraanivett analüüsitakse pärast esimeste portsjonite tühjendamist, kuna need võivad sisaldada torudesse ja kraanidesse kogunenud mikroobe. Puu-, marja- ja juurviljade mikrofloora paikneb peamiselt pinnal (koorel), seetõttu tehakse sellelt ka pesu. Selleks asetage loode steriilsesse anumasse ja täitke see vajaliku koguse veega. Seejärel loksutatakse neid päris tugev alt ja vesi valatakse teise anumasse. Kangatoodetest saadakse saaki ka tampoonidena, kuid eelnev alt lõigatakse neist etteantud suurusega tükid välja.