Kaasaegne bioloogia hämmastab oma avastuste unikaalsuse ja ulatusega. Tänapäeval uurib see teadus enamikku meie silmade eest varjatud protsesse. See on märkimisväärne molekulaarbioloogia jaoks – üks paljutõotav valdkond, mis aitab lahti harutada elusaine kõige keerulisemaid saladusi.
Mis on pöördtranskriptsioon
Pöördtranskriptsioon (lühid alt RT) on spetsiifiline protsess, mis on iseloomulik enamikule RNA viirustele. Selle peamine omadus on kaheahelalise DNA molekuli süntees, mis põhineb sõnumitooja RNA-l.
OT ei ole iseloomulik bakteritele ega eukarüootsetele organismidele. Peamine ensüüm, reversetaas, mängib kaheahelalise DNA sünteesis võtmerolli.
Avastuste ajalugu
Mõtet, et ribonukleiinhappemolekulist võiks saada DNA sünteesi malli, peeti absurdseks kuni 1970. aastateni. Seejärel avastasid B altimore ja Temin, töötades üksteisest eraldi, peaaegu samaaegselt uue ensüümi. Nad nimetasid seda RNA-st sõltuvaks DNA polümeraasiks või pöördtranskriptaasiks.
Selle ensüümi avastamine kinnitas tingimusteta organismide olemasoluvõimeline pöördtranskriptsiooniks. Mõlemad teadlased said 1975. aastal Nobeli preemia. Mõne aja pärast pakkus Engelhardt välja pöördtranskriptaasi alternatiivse nimetuse – revertaas.
Miks OT on vastuolus molekulaarbioloogia keskse dogmaga
Keskdogma on järjestikuse valgusünteesi kontseptsioon mis tahes elusrakus. Selline skeem koosneb kolmest komponendist: DNA, RNA ja valk.
Vastav alt kesksele dogmale saab RNA-d sünteesida eranditult DNA matriitsil ja alles siis osaleb RNA valgu primaarse struktuuri loomisel.
See dogma võeti teadusringkondades ametlikult vastu enne pöördtranskriptsiooni avastamist. Pole üllatav, et RNA-st DNA pöördsünteesi idee on teadlased juba ammu tagasi lükanud. Alles 1970. aastal koos reversetaasi avastamisega lõppes see probleem, mis kajastus valgusünteesi kontseptsioonis.
Lindude retroviiruste ümberpööramine
Pöördtranskriptsiooni protsess ei ole täielik ilma RNA-sõltuva DNA polümeraasi osaluseta. Lindude retroviiruse revertaasi on seni uuritud maksimaalsel määral.
Selle viiruste perekonna ühest virionist võib leida ainult umbes 40 selle valgu molekuli. Valk koosneb kahest alaühikust, mida on võrdselt ja mis täidavad kolme olulist pöördfunktsiooni:
1) DNA molekuli süntees nii üheahelalisel/kaheahelalisel RNA matriitsil kui ka desoksüribonukleiinhapete baasil.
2) RNaasi H aktiveerimine, mille peamine roll onRNA molekuli lõhustamine RNA-DNA kompleksis.
3) DNA molekulide lõikude hävitamine eukarüootse genoomi sisestamiseks.
Mehhanism OT
Pöördtranskriptsiooni etapid võivad erineda olenev alt viiruste perekonnast, st. nende nukleiinhapete tüübi kohta.
Võtleme kõigepe alt need viirused, mis kasutavad reversetaasi. Siin on OT-protsess jagatud kolmeks etapiks:
1) RNA ahela "-" süntees RNA ahela "+" mallil.
2) RNA "+" ahela hävitamine RNA-DNA kompleksis ensüümi RNaas H abil.
3) Kaheahelalise DNA molekuli süntees RNA ahela matriitsi "-" peal.
See virionide paljunemise meetod on tüüpiline mõnede onkogeensete viiruste ja inimese immuunpuudulikkuse viiruse (HIV) puhul.
Väärib märkimist, et mis tahes nukleiinhappe sünteesiks RNA matriitsil on vaja külvi või praimerit. Praimer on lühike nukleotiidide jada, mis on komplementaarne RNA molekuli (matriitsi) 3'-otsaga ja mängib olulist rolli sünteesi käivitamisel.
Kui viirusliku päritoluga valmis kaheahelalised DNA molekulid integreeritakse eukarüootse genoomi, käivitub tavaline virioni valkude sünteesi mehhanism. Selle tulemusel saab viiruse poolt “püütud” rakust virionide tootmistehas, kus moodustuvad suurtes kogustes vajalikud valgud ja RNA molekulid.
Teine pöördtranskriptsiooni viis põhineb RNA süntetaasi toimel. See valk on aktiivne paramüksoviiruste, rabdoviiruste, pikornoviiruste vastu. Sel juhul puudub OT kolmas etapp - moodustuminekaheahelaline DNA ja selle asemel sünteesitakse viiruse "-" RNA ahela mallil RNA ahel ja vastupidi.
Selliste tsüklite kordumine viib nii viiruse genoomi replikatsioonini kui ka nakatunud eukarüootse raku tingimustes valkude sünteesiks võimelise mRNA moodustumiseni.
Pöördtranskriptsiooni bioloogiline tähtsus
OT-protsess on paljude viiruste (peamiselt retroviiruste nagu HIV) elutsüklis ülim alt tähtis. Eukarüootset rakku rünnanud virioni RNA-st saab esimese DNA ahela sünteesi matriits, millel ei ole raske teist ahelat lõpule viia.
Saadud viiruse kaheahelaline DNA integreeritakse eukarüootse genoomi, mis viib virioni valgu sünteesi protsesside aktiveerimiseni ja suure hulga selle koopiate ilmumiseni nakatunud rakus. See on Revertase ja üldiselt OT peamine missioon viiruse jaoks.
Pöördtranskriptsioon võib toimuda ka eukarüootides retrotransposoonide kontekstis – mobiilsed geneetilised elemendid, mis võivad iseseisv alt transportida ühest genoomi osast teise. Teadlaste sõnul põhjustasid sellised elemendid elusorganismide evolutsiooni.
Retrotransposoon on eukarüootse DNA osa, mis kodeerib mitmeid valke. Üks neist, reversetaas, on otseselt seotud sellise retrotransporosooni ümberpaiknemisega.
OT kasutamine teaduses
Alates hetkest, mil reversetaas eraldati puhtal kujul, on bioloogid kasutusele võtnud pöördtranskriptsiooni protsessi. OT mehhanismi uurimine aitab endiselt lugeda inimese kõige olulisemate valkude järjestusi.
Fakt on see, et eukarüootide, sealhulgas meie genoom sisaldab mitteinformatiivseid piirkondi, mida nimetatakse introniteks. Kui sellisest DNA-st loetakse nukleotiidjärjestus ja moodustub üheahelaline RNA, kaotab viimane intronid ja kodeerib eranditult valku. Kui DNA sünteesitakse RNA matriitsi reversetaasi abil, on seda lihtne järjestada ja nukleotiidide järjestust teada saada.
Nukleiinhapet, mis on moodustunud pöördtranskriptaasi toimel, nimetatakse cDNA-ks. Seda kasutatakse sageli polümeraasi ahelreaktsioonis (PCR), et kunstlikult suurendada saadud cDNA koopia koopiate arvu. Seda meetodit ei kasutata mitte ainult teaduses, vaid ka meditsiinis: laborandid määravad kindlaks sellise DNA sarnasuse erinevate bakterite või viiruste genoomidega ühisest raamatukogust. Vektorite süntees ja nende viimine bakteritesse on üks paljulubavamaid bioloogia valdkondi. Kui RT-d kasutatakse inimeste ja teiste organismide DNA moodustamiseks ilma introniteta, saab selliseid molekule kergesti sisestada bakteri genoomi. Nii saavad viimastest tehased inimesele vajalike ainete (näiteks ensüümide) tootmiseks.
