Rakukultuur sõltub suuresti tingimustest. Need on iga rakutüübi puhul erinevad, kuid koosnevad tavaliselt sobivast anumast substraadi või söötmega, mis varustab vajalikke toitaineid (aminohapped, süsivesikud, vitamiinid, mineraalid), kasvufaktoreid, hormoone ja gaase (CO2, O2) ning reguleerib -keemiline keskkond (puhvri pH, osmootne rõhk, temperatuur). Enamik rakke vajab pinna- või tehissubstraati (adhesiivne või ühekihiline kultuur), samas kui teisi saab kultuurisöötmes vab alt paljundada (suspensioonkultuur). Enamiku rakkude eluiga on geneetiliselt määratud, kuid mõned rakukultuurid on muudetud surematuteks rakkudeks, mis optimaalsete tingimuste loomisel paljunevad lõputult.
Definitsioon
Ssiinne määratlus on üsna lihtne. Praktikas viitab termin "rakukultuur" nüüd mitmerakulistest eukarüootidest pärinevate rakkude, eriti loomarakkude kultiveerimisele, erinev alt teist tüüpi kultuuridest. Ajalooline areng ja kultiveerimismeetodid on tihed alt seotud koekultuuri ja elundikultuuriga. Viiruskultuuri seostatakse ka rakkudega kui viiruste peremeesorganismidega.
Ajalugu
Laboratoorsed tehnikad algsest koeallikast eraldatud rakkude saamiseks ja kultiveerimiseks muutusid 20. sajandi keskel tugevamaks. Peamised läbimurded selles valdkonnas tegid Yale'i ülikooli teadlased.
Sajandi keskpaiga läbimurre
Algselt harjutati rakkude hankimist ja kasvatamist selleks, et leida imerohi paljude ohtlike viiruste vastu. Mitmed teadlased on avastanud, et paljud viirusetüved võivad turvaliselt elada, areneda ja paljuneda kunstlikult kasvatatud loomarakkudel või isegi tervetel elunditel, mida hoitakse autonoomselt spetsiaalsetes kolbides. Reeglina kasutatakse sellisteks katseteks loomade elundite rakke, mis on inimesele võimalikult lähedal – näiteks kõrgemate primaatide nagu šimpansid. Kõik need avastused tehti 1940. aastatel, kui inimestega tehtud katsed olid teatud põhjustel kõige olulisemad.
Metoodika
Rakke saab kudedest ex vivo kultiveerimiseks eraldada mitmel viisil. Neid saab kergesti verest puhastada, kuid kultuuris on võimelised kasvama ainult valged rakud. Rakud võivaderaldatakse tahkest kudedest ekstratsellulaarse maatriksi seedimise teel, kasutades ensüüme, nagu kollagenaas, trüpsiin või pronaas, enne koe loksutamist, et vabastada rakud suspensiooni. Teise võimalusena võib koetükke asetada kasvusöötmesse ja kasvavad rakud on kultiveerimiseks saadaval. Seda meetodit tuntakse eksplantaadikultuurina.
Rakke, mida kasvatatakse otse subjektilt, nimetatakse primaarseteks rakkudeks. Enamiku primaarsete rakukultuuride eluiga on piiratud, välja arvatud mõned kasvajatest pärinevad rakud.
Surematud ja tüvirakud
Väljakujunenud või immortaliseeritud rakuliin on omandanud võime lõputult paljuneda kas juhusliku mutatsiooni või tahtliku modifikatsiooni, näiteks telomeraasi geeni kunstliku ekspressiooni kaudu. Paljud rakuliinid on hästi tuntud tüüpiliste rakutüüpidena.
Loomade rakuliinide massiline kultiveerimine on viirusvaktsiinide ja muude biotehnoloogiatoodete tootmisel põhiline. Inimese tüvirakkude kultuuri kasutatakse nende arvu suurendamiseks ja rakkude eristamiseks siirdamiseks sobivateks erinevateks tüüpideks. Inimese (tüvi)rakukultuuri kasutatakse ka tüvirakkudest vabastatud molekulide ja eksosoomide kogumiseks ravi eesmärgil.
Seos geneetikaga
Loomakultuurides rekombinantse DNA (rDNA) tehnoloogia abil toodetud bioloogilised tooted hõlmavadensüümid, sünteetilised hormoonid, immunobioloogilised (monoklonaalsed antikehad, interleukiinid, lümfokiinid) ja vähivastased ained. Kui paljusid lihtsamaid valke saab valmistada rDNA abil bakterikultuurides, siis keerulisemaid glükosüülitud (süsivesikutega modifitseeritud) valke tuleb praegu valmistada loomarakkudes.
Sellise keerulise valgu oluline näide on hormoon erütropoetiin. Imetajate rakukultuuride kasvatamise kulud on suured, mistõttu on käimas uuringud selliste komplekssete valkude loomiseks putukarakkudes või kõrgemates taimedes. Üks selle rakendustest on üksikute embrüonaalsete rakkude ja somaatiliste embrüote kasutamine otsese geeniülekande allikana osakeste pommitamise, mööduvate geenide ekspressiooni ja konfokaalse mikroskoopia abil. Taimerakukultuur on selle praktika kõige levinum vorm.
Koekultuurid
Koekultuur on organismist eraldatud kudede või rakkude kasvatamine. Selle protsessi hõlbustamiseks kasutatakse tavaliselt vedelat, pooltahket või tahket kasvusöödet, nagu puljong või agar. Koekultuur viitab üldiselt loomarakkude ja -kudede kultuurile, täpsemat terminit kasutatakse taimede, taimerakkude ja koekultuuride kohta. Mõiste "koekultuur" võttis kasutusele Ameerika patoloog Montrose Thomas Burroughs.
Koekultuuri ajalugu
1885. aastal eemaldas Wilhelm Roux osa medullaarsestkana loote plaadid ja hoiti seda mitu päeva soojas soolalahuses, kehtestades koekultuuri põhiprintsiibi. 1907. aastal demonstreeris zooloog Ross Granville Harrison embrüonaalsete konnarakkude kasvu, mis tekitavad hüübinud lümfis närvirakke. 1913. aastal kultiveerisid E. Steinhardt, C. Israel ja R. A. Lambert merisea sarvekoe fragmentides vaktsiiniaviirust. See oli juba midagi palju arenenumat kui taimerakukultuur.
Minevikust tulevikku
Gotlieb Haberlandt juhtis esimesena tähelepanu isoleeritud taimekudede kultiveerimise võimalusele. Ta pakkus välja, et selle meetodi abil saab koekultuuri kaudu määrata üksikute rakkude võimeid, aga ka kudede vastastikust mõju üksteisele. Kui Haberlandi algsed väited realiseerusid, hakati aktiivselt rakendama koe- ja rakukultuuritehnikaid, mis viis uute avastusteni bioloogias ja meditsiinis. Tema 1902. aastal esitatud algne idee kandis nime totipotentsiaal: "Teoreetiliselt on kõik taimerakud võimelised tootma terviklikku taime." Rakukultuuride kasvatamine arenes sel ajal dramaatiliselt.
Kaasaegses kasutuses tähendab koekultuur üldiselt rakkude kasvu mitmerakulise organismi koest in vitro. Rakukultuuri tingimused ei ole sel juhul eriti olulised. Neid rakke võib eraldada doonororganismist, primaarsetest rakkudest või immortaliseeritud rakuliinist. Rakud pesevadsööde, mis sisaldab nende ellujäämiseks vajalikke toitaineid ja energiaallikaid. Mõistet "koekultuur" kasutatakse sageli vaheldumisi rakukultuuriga.
Rakendus
Koekultuuri sõnasõnaline tähendus viitab koetükkide kultiveerimisele, st eksplantaadikultuurile.
Koekultuur on oluline vahend mitmerakuliste organismide rakkude bioloogia uurimiseks. See pakub in vitro koemudelit täpselt määratletud keskkonnas, mida saab hõlpsasti manipuleerida ja analüüsida.
Loomade koekultuuris saab rakke kasvatada 2D-monokihtidena (tavaline kultuur) või kiulistes karkassides või geelides, et saavutada loomulikumad 3D-koelaadsed struktuurid (3D-kultuur). Eric Simon näitas 1988. aasta NIH SBIRi stipendiumiaruandes, et elektriketrust saab kasutada nano- ja submikroni ulatusega polümeerkiudkarkasside tootmiseks, mis on spetsiaalselt ette nähtud kasutamiseks rakkude ja kudede substraatidena in vitro.
See elektrit juhtivate kiudvõrkude varajane kasutamine rakukultuuris ja koetehnoloogias näitas, et erinevat tüüpi rakud kleepuvad ja vohavad polükarbonaatkiududele. On täheldatud, et erinev alt lamestatud morfoloogiast, mida tavaliselt täheldatakse 2D kultuuris, on elektrijuhtmekiududel kasvatatud rakkudel ümaram 3D morfoloogia, mida tavaliselt täheldatakse in vivo kudedes.
Kultuureriti taimekude on seotud tervete taimede kasvatamisega väikestest taimsete kiudude tükkidest, mida kasvatatakse söötmes.
Mudelite erinevused
Koetehnoloogia, tüvirakkude ja molekulaarbioloogia alased uuringud hõlmavad peamiselt rakukultuuride kasvatamist tasastel plastnõudel. Seda meetodit tuntakse kahemõõtmelise (2D) rakukultuurina ja selle töötas esmakordselt välja Wilhelm Roux, kes 1885. aastal eemaldas osa embrüonaalse kana medullaarsest plaadist ja hoidis seda mitu päeva soojas soolalahuses tasasel klaasil.
Polümeertehnoloogia arengust on tekkinud kaasaegne standardne kahemõõtmelise rakukultuuri plastnõu, mida tavaliselt tuntakse Petri tassina. Saksa bakterioloog Julius Richard Petri, keda teaduskirjanduses tavaliselt selle leiutise leiutajaks peetakse, töötas Robert Kochi assistendina. Tänapäeval kasutavad mitmed teadlased ka kultiveerimiskolbe, koonuseid ja isegi ühekordseid kotte, nagu neid, mida kasutatakse ühekordselt kasutatavates bioreaktorites.
Lisaks väljakujunenud immortaliseeritud rakuliinide kultiveerimisele saab piiratud aja jooksul kultiveerida paljude organismide esmase eksplantaadi rakke, kuni vastuvõtlikkus ilmneb. Kultiveeritud primaarseid rakke on teadusuuringutes laialdaselt kasutatud, nagu kalade keratotsüütide puhul rakkude migratsiooniuuringutes. Rakukultuuri söödet saab kasutada enamikuserinev.
Taimerakukultuure kasvatatakse tavaliselt rakususpensiooni kultuuridena vedelas söötmes või kallusekultuurides tahkel söötmel. Diferentseerumata taimerakkude ja kallide kultiveerimiseks on vaja taimede kasvuhormoonide auksiini ja tsütokiniini õiget tasakaalu.
