Valk on kõigi organismide oluline komponent. Iga selle molekul koosneb ühest või mitmest aminohapetest koosnevast polüpeptiidahelast. Kuigi eluks vajalik informatsioon on kodeeritud DNA-s või RNA-s, täidavad rekombinantsed valgud organismides väga erinevaid bioloogilisi funktsioone, sealhulgas ensümaatilist katalüüsi, kaitset, toetamist, liikumist ja reguleerimist. Vastav alt nende funktsioonidele organismis võib need ained jagada erinevatesse kategooriatesse, nagu antikehad, ensüümid, struktuursed komponendid. Arvestades nende olulisi funktsioone, on selliseid ühendeid intensiivselt uuritud ja laialdaselt kasutatud.
Varem oli peamine viis rekombinantse valgu saamiseks eraldada see looduslikust allikast, mis on tavaliselt ebaefektiivne ja aeganõudev. Hiljutised edusammud bioloogilises molekulaartehnoloogias on võimaldanud kloonida spetsiifilist ainete komplekti kodeerivat DNA-d ekspressioonivektorisse selliste ainete jaoks nagu bakterid, pärm, putukarakud ja imetajarakud.
Lihtsam alt öeldes tõlgitakse rekombinantsed valgud eksogeensete DNA saaduste abilelusrakud. Nende hankimine hõlmab tavaliselt kahte peamist sammu:
- Molekuli kloonimine.
- Valgu ekspressioon.
Praegu on sellise struktuuri valmistamine üks võimsamaid meetodeid, mida meditsiinis ja bioloogias kasutatakse. Kompositsioonil on laialdane rakendus teadusuuringutes ja biotehnoloogias.
Meditsiinisuund
Rekombinantsed valgud pakuvad olulist ravi mitmesuguste haiguste, nagu diabeet, vähk, nakkushaigused, hemofiilia ja aneemia puhul. Selliste ainete tüüpiliste koostiste hulka kuuluvad antikehad, hormoonid, interleukiinid, ensüümid ja antikoagulandid. Kasvab vajadus terapeutiliseks kasutamiseks mõeldud rekombinantsete preparaatide järele. Need võimaldavad teil ravimeetodeid laiendada.
geneetiliselt muundatud rekombinantsed valgud mängivad terapeutiliste ravimite turul võtmerolli. Imetajarakud toodavad praegu kõige rohkem raviaineid, kuna nende koostised on võimelised tootma kvaliteetseid looduslikke aineid. Lisaks toodetakse E. coli-s palju heakskiidetud rekombinantseid terapeutilisi valke tänu heale geneetikale, kiirele kasvule ja kõrgele tootlikkusele. Sellel on positiivne mõju ka sellel ainel põhinevate ravimite väljatöötamisele.
Uuring
Rekombinantsete valkude saamine põhineb erinevatel meetoditel. Ained aitavad välja selgitada organismi põhi- ja põhiprintsiibid. Neid molekule saab kasutada tuvastamiseks ja määramisekskonkreetse geeni poolt kodeeritud aine asukohta ja paljastada teiste geenide funktsioonid erinevates rakulistes tegevustes, nagu rakkude signaalimine, metabolism, kasv, replikatsioon ja surm, transkriptsioon, translatsioon ja artiklis käsitletud ühendite modifitseerimine.
Seega kasutatakse vaadeldud koostist sageli molekulaarbioloogias, rakubioloogias, biokeemias, struktuuri- ja biofüüsikalistes uuringutes ning paljudes teistes teadusvaldkondades. Samal ajal on rekombinantsete valkude saamine rahvusvaheline tava.
Sellised ühendid on kasulikud vahendid rakkudevahelise interaktsiooni mõistmiseks. Need on osutunud tõhusaks mitmetes laboratoorsetes meetodites, nagu ELISA ja immunohistokeemia (IHC). Rekombinantseid valke saab kasutada ensüümanalüüside väljatöötamiseks. Kui neid kasutatakse koos paari sobiva antikehaga, saab rakke kasutada uute tehnoloogiate standarditena.
Biotehnoloogia
Aminohappejärjestust sisaldavaid rekombinantseid valke kasutatakse ka tööstuses, toiduainete tootmises, põllumajanduses ja biotehnoloogias. Näiteks loomakasvatuses võib toidule lisada ensüüme, et tõsta sööda koostisosade toiteväärtust, vähendada kulusid ja jäätmeid, toetada loomade soolestiku tervist, parandada tootlikkust ja parandada keskkonda.
Lisaks piimhappebakterid (LAB) pikka aegaon kasutatud kääritatud toitude tootmiseks ning hiljuti töötati LAB välja aminohappejärjestust sisaldavate rekombinantsete valkude ekspressiooniks, mida saab laialdaselt kasutada näiteks inimeste, loomade ja toitainete seedimise parandamiseks.
Nendel ainetel on siiski ka piirangud:
- Mõnel juhul on rekombinantsete valkude tootmine keeruline, kulukas ja aeganõudev.
- Rakkudes toodetud ained ei pruugi vastata looduslikele vormidele. See erinevus võib vähendada terapeutiliste rekombinantsete valkude efektiivsust ja isegi põhjustada kõrv altoimeid. Lisaks võib see erinevus mõjutada katsete tulemusi.
- Kõigi rekombinantsete ravimite peamine probleem on immunogeensus. Kõik biotehnoloogilised tooted võivad avaldada teatud vormis immunogeensust. Uute ravivalkude ohutust on raske ennustada.
Üldiselt on biotehnoloogia areng suurendanud ja hõlbustanud rekombinantsete valkude tootmist mitmesugusteks rakendusteks. Kuigi neil on endiselt mõningaid puudusi, on need ained olulised meditsiinis, teadusuuringutes ja biotehnoloogias.
Haiguse link
rekombinantne valk ei ole inimesele kahjulik. See on vaid lahutamatu osa üldisest molekulist konkreetse ravimi või toiteelemendi väljatöötamisel. Paljud meditsiinilised uuringud on näidanud, et FGFBP3 valgu (lühendatult BP3) sunnitud ekspressioon rasvunud hiirte laboratoorses tüves näitas nende keharasva olulist vähenemist.mass, hoolimata geneetilisest eelsoodumusest kasutada.
Nende uuringute tulemused näitavad, et valk FGFBP3 võib pakkuda uut ravi metaboolse sündroomiga seotud häirete puhul, nagu 2. tüüpi diabeet ja rasvmaksahaigus. Kuid kuna BP3 on looduslik valk, mitte kunstlik ravim, võivad inimese rekombinantse BP3 kliinilised uuringud alata pärast eelkliiniliste uuringute viimast vooru. See tähendab, et selliste uuringute läbiviimise ohutusega on seotud põhjused. Rekombinantne valk ei ole selle järkjärgulise töötlemise ja puhastamise tõttu inimestele kahjulik. Muutused toimuvad ka molekulaarsel tasandil.
PD-L2, immunoteraapia üks võtmeisikuid, nimetati 2018. aasta Nobeli füsioloogia- või meditsiiniauhinna kandidaadiks. See USA-st pärit prof James P. Allisoni ja jaapanlase prof Tasuku Honjo alustatud töö on viinud kontrollpunkti immunoteraapial põhineva vähivormide, nagu melanoom, kopsuvähk jt ravini. Hiljuti on AMSBIO lisanud oma immunoteraapia sarja suure uue toote – PD-L2/TCR aktivaatori – CHO rekombinantse rakuliini.
Konseptsiooni tõestamise katsetes osalesid Birminghami Alabama ülikooli teadlased eesotsas doktor H. Long Zheng, professor Robert B. Adams ja UAB School of Patoloogiaosakonna laborimeditsiini direktor. Meditsiin on esile tõstnud võimaliku ravi haruldase, kuid surmaga lõppeva veritsushäire TTP.
Selle tulemuseduuringud näitavad esimest korda, et rADAMTS13-ga laetud trombotsüütide transfusioon võib olla uudne ja potentsiaalselt tõhus ravimeetod kaasasündinud ja immuunvahendatud TTP-ga seotud arteriaalse tromboosi korral.
Rekombinantne valk ei ole mitte ainult toitaine, vaid ka ravim väljatöötatava ravimi koostises. Need on vaid mõned valdkonnad, mis on praegu seotud meditsiiniga ja on seotud kõigi selle struktuurielementide uurimisega. Nagu näitab rahvusvaheline praktika, võimaldab aine struktuur molekulaarsel tasandil toime tulla paljude tõsiste inimkeha probleemidega.
Vaktsiini väljatöötamine
Rekombinantne valk on spetsiifiline molekulide komplekt, mida saab modelleerida. Sarnast omadust kasutatakse ka vaktsiinide väljatöötamisel. Edinburghi ülikooli ja Pirbrighti instituudi teadlased ütlesid, et uus vaktsineerimisstrateegia, mida tuntakse ka kui spetsiaalse rekombinantse viirusesüsti kasutamist, võib kaitsta miljoneid kanu, keda ohustab tõsine hingamisteede haigus. Need vaktsiinid kasutavad viiruse või bakteri kahjutuid või nõrku versioone, et viia mikroobid keharakkudesse. Sel juhul kasutasid eksperdid kahjutu viiruse kahe versiooni loomiseks vaktsiinidena rekombinantseid viiruseid, millel olid erinevad teravikvalgud. Selle ühenduse ümber on ehitatud palju erinevaid ravimeid.
Rekombinantsete valkude kaubanimed ja analoogid on järgmised:
- "Fortelizin".
- "Z altrap".
- "Eylea".
Need on peamiselt vähivastased ravimid, kuid selle toimeainega on seotud ka teisi ravivaldkondi.
Uus vaktsiin, mida nimetatakse ka LASSARABiks, mis on loodud inimeste kaitsmiseks nii Lassa palaviku kui ka marutaudi eest, on andnud prekliinilistes uuringutes paljulubavaid tulemusi, selgub teadusajakirjas Nature Communications avaldatud uuest uuringust. Inaktiveeritud rekombinantse vaktsiini kandidaat kasutab nõrgestatud marutaudiviirust.
Uurimisrühm sisestas Lassa viiruse geneetilise materjali marutaudiviiruse vektorisse, et vaktsiin ekspresseeriks pinnavalke nii Lassa kui ka marutaudirakkudes. Need pinnaühendid kutsuvad esile immuunvastuse nakkusetekitajate vastu. Seejärel see vaktsiin inaktiveeriti, et "hävitada" selle kandja moodustamiseks kasutatud elus marutaudiviirus.
Meetodite hankimine
Aine tootmiseks on mitu süsteemi. Üldine meetod rekombinantse valgu saamiseks põhineb sünteesist bioloogilise materjali saamisel. Kuid on ka teisi viise.
Praegu on viis peamist väljendussüsteemi:
- E. coli ekspressioonisüsteem.
- Pärmi ekspressioonisüsteem.
- Putukate rakkude ekspressioonisüsteem.
- Imetajarakkude ekspressioonisüsteem.
- Rakuvaba valgu ekspressioonisüsteem.
Viimane variant sobib eriti hästi transmembraansete valkude ekspressiooniksja toksilised ühendid. Viimastel aastatel on in vitro eduk alt rakkudesse integreeritud aineid, mida on tavapäraste intratsellulaarsete meetoditega raske ekspresseerida. Valgevenes kasutatakse laialdaselt rekombinantsete valkude tootmist. Selle probleemiga tegelevad mitmed riigiettevõtted.
Cell Free Protein Synthesis System on kiire ja tõhus meetod sihtainete sünteesimiseks, lisades erinevaid substraate ja energiaühendeid, mis on vajalikud transkriptsiooniks ja translatsiooniks rakuekstraktide ensümaatilises süsteemis. Viimastel aastatel on järk-järgult esile kerkinud rakuvabade meetodite eelised selliste ainete puhul nagu keerulised toksilised membraanid, mis näitab nende potentsiaalset kasutamist biofarmatseutilises valdkonnas.
Rakuvaba tehnoloogia abil saab hõlpsasti ja kontrollitult lisada mitmesuguseid looduslikult mitteesinevaid aminohappeid, et saavutada keerukaid modifitseerimisprotsesse, mida on pärast tavapärast rekombinantset ekspressiooni raske lahendada. Sellistel meetoditel on kõrge rakendusväärtus ja potentsiaal ravimite kohaletoimetamiseks ja viiruselaadsete osakeste abil vaktsiinide väljatöötamiseks. Vabades rakkudes on eduk alt ekspresseeritud suur hulk membraanivalke.
Kompositsioonide väljendus
Rekombinantset valku CFP10-ESAT 6 toodetakse ja kasutatakse vaktsiinide loomiseks. Selline tuberkuloosi allergeen võimaldab teil tugevdada immuunsüsteemi ja arendada antikehi. Üldiselt hõlmavad molekulaaruuringud valgu mis tahes aspekti, nagu struktuur, funktsioon, modifikatsioonid, lokaliseerimine või interaktsioonid, uurimist. Uuridakuidas konkreetsed ained reguleerivad sisemisi protsesse, vajavad teadlased tavaliselt vahendeid huvipakkuvate ja kasulike funktsionaalsete ühendite tootmiseks.
Arvestades valkude suurust ja keerukust, ei ole keemiline süntees selle ettevõtmise jaoks elujõuline valik. Selle asemel kasutatakse elusrakke ja nende rakulisi masinaid tavaliselt tehastena, et luua ja konstrueerida aineid, mis põhinevad esitatud geneetilistel mallidel. Seejärel loob rekombinantse valgu ekspressioonisüsteem vajaliku struktuuri ravimi loomiseks. Järgmiseks tuleb erinevate ravimite kategooriate jaoks vajaliku materjali valik.
Erinev alt valkudest on DNA-d lihtne sünteetiliselt või in vitro konstrueerida, kasutades hästi väljakujunenud rekombinantseid tehnikaid. Seetõttu saab spetsiifiliste geenide DNA malle, millele on lisatud reporterjärjestused või afiinsusmärgise järjestused või ilma, kujundada jälgitava aine ekspressiooni mallidena. Selliseid DNA matriitsidest tuletatud ühendeid nimetatakse rekombinantseteks valkudeks.
Aine ekspressiooni traditsioonilised strateegiad hõlmavad rakkude transfekteerimist DNA vektoriga, mis sisaldab matriitsi, ja seejärel rakkude kultiveerimist soovitud valgu transkribeerimiseks ja transleerimiseks. Tavaliselt rakud lüüsitakse seejärel ekspresseeritud ühendi ekstraheerimiseks järgnevaks puhastamiseks. Rekombinantset valku CFP10-ESAT6 töödeldakse sel viisil ja see läbib võimalikust puhastussüsteemi.toksiinide moodustumist. Alles pärast seda sünteesitakse see vaktsiiniks.
Nii prokarüootseid kui ka eukarüootseid molekulaarsete ainete in vivo ekspressioonisüsteeme kasutatakse laialdaselt. Süsteemi valik sõltub valgu tüübist, funktsionaalse aktiivsuse nõudest ja soovitud saagisest. Nende ekspressioonisüsteemide hulka kuuluvad imetajad, putukad, pärmid, bakterid, vetikad ja rakud. Igal süsteemil on oma eelised ja väljakutsed ning konkreetse rakenduse jaoks õige süsteemi valimine on oluline läbivaatatava aine edukaks väljendamiseks.
Imetajate väljendus
Rekombinantsete valkude kasutamine võimaldab välja töötada erineva tasemega vaktsiine ja ravimeid. Selleks saab kasutada seda aine saamise meetodit. Imetajate ekspressioonisüsteeme saab kasutada loomariigist pärit valkude tootmiseks, millel on nende füsioloogiliselt olulise keskkonna tõttu kõige loomulikum struktuur ja aktiivsus. Selle tulemuseks on translatsioonijärgse töötlemise ja funktsionaalse aktiivsuse kõrge tase. Imetajate ekspressioonisüsteeme saab kasutada antikehade, kompleksvalkude ja ühendite tootmiseks, mida kasutatakse rakupõhistes funktsionaalsetes analüüsides. Need eelised on aga seotud rangemate kultiveerimistingimustega.
Imetajate ekspressioonisüsteeme saab kasutada valkude genereerimiseks ajutiselt või stabiilsete rakuliinide kaudu, kus ekspressioonikonstrukt on integreeritud peremeesgenoomi. Kuigi selliseid süsteeme saab kasutada mitmes katses, on aegtootmine võib tekitada suure koguse ainet ühe kuni kahe nädala jooksul. Seda tüüpi rekombinantse valgu biotehnoloogia järele on suur nõudlus.
Need mööduvad, suure saagikusega imetajate ekspressioonisüsteemid kasutavad suspensioonikultuure ja võivad anda gramme liitri kohta. Lisaks on neil valkudel rohkem natiivseid voltimis- ja translatsioonijärgseid modifikatsioone, nagu glükosüülimine, võrreldes teiste ekspressioonisüsteemidega.
Putukate väljendus
Rekombinantse valgu tootmise meetodid ei piirdu ainult imetajatega. Tootmiskulude osas on ka tootlikumaid viise, kuigi aine saagis 1 liitri töödeldud vedeliku kohta on palju väiksem.
Putukate rakke saab kasutada kõrgetasemelise valgu ekspresseerimiseks imetajate süsteemidele sarnaste modifikatsioonidega. On mitmeid süsteeme, mida saab kasutada rekombinantse bakuloviiruse genereerimiseks, mida saab seejärel kasutada huvipakkuva aine ekstraheerimiseks putukarakkudest.
Rekombinantsete valkude ekspressioone saab hõlpsasti suurendada ja kohandada suure tihedusega suspensioonikultuuriga molekulide suuremahuliseks liitmiseks. Need on funktsionaalselt sarnasemad imetajate aine loomuliku koostisega. Kuigi saagis võib olla kuni 500 mg/l, võib rekombinantse bakuloviiruse tootmine olla aeganõudev ja kultiveerimistingimused on keerulisemad kui prokarüootsed süsteemid. Lõunapoolsemates ja soojemates maades aga sarnanemeetodit peetakse tõhusamaks.
Bakteriaalne ekspressioon
Rekombinantsete valkude tootmist saab luua bakterite abil. See tehnoloogia erineb oluliselt ülalkirjeldatust. Bakteriaalsed valguekspressioonisüsteemid on populaarsed, kuna baktereid on lihtne kultiveerida, nad kasvavad kiiresti ja annavad suure rekombinantse preparaadi saagise. Bakterites ekspresseeritud mitmedomeenilised eukarüootsed ained on aga sageli mittefunktsionaalsed, kuna rakud ei ole varustatud vajalike translatsioonijärgsete modifikatsioonide või molekulaarse voltimise tegemiseks.
Lisaks muutuvad paljud valgud inklusioonmolekulidena lahustumatuks, mida on väga raske taastada ilma karmide denaturaatorite ja sellele järgnevate tülikate molekulaarsete ümbervoltimisprotseduurideta. Seda meetodit peetakse enamasti endiselt suures osas eksperimentaalseks.
Kärgivaba väljendus
Stafülokinaasi aminohappejärjestust sisaldav rekombinantne valk saadakse veidi teistsugusel viisil. See sisaldub paljudes süstimistüüpides, enne kasutamist on vaja mitut süsteemi.
Rakuvaba valgu ekspressioon on aine süntees in vitro, kasutades translatsiooniliselt ühilduvaid täisrakuekstrakte. Põhimõtteliselt sisaldavad terved rakuekstraktid kõiki transkriptsiooniks, translatsiooniks ja isegi translatsioonijärgseks muutmiseks vajalikke makromolekule ja komponente.
Nende komponentide hulka kuuluvad RNA polümeraas, reguleerivad valgufaktorid, transkriptsioonivormid, ribosoomid ja tRNA. Lisamiselkofaktorite, nukleotiidide ja spetsiifilise geenimatriitsi abil suudavad need ekstraktid sünteesida huvipakkuvaid valke mõne tunniga.
Kuigi see ei ole suuremahulise tootmise jaoks jätkusuutlik, pakuvad rakuvabad või in vitro valguekspressioonisüsteemid (IVT) tavapäraste in vivo süsteemide ees mitmeid eeliseid.
Rakuvaba ekspressioon võimaldab rekombinantsete preparaatide kiiret sünteesi ilma rakukultuuri kaasamata. Rakuvabad süsteemid võimaldavad märgistada valke modifitseeritud aminohapetega, samuti ekspresseerida ühendeid, mis läbivad kiire proteolüütilise lagunemise rakusiseste proteaaside toimel. Lisaks on rakuvaba meetodiga (näiteks valkude mutatsioonide testimine väikesemahulise ekspressiooniga paljudest erinevatest rekombinantse DNA matriitsist) lihtsam ekspresseerida korraga. Selles tüüpilises katses kasutati inimese kaspaas-3 valgu ekspresseerimiseks IVT-süsteemi.
Järeldused ja tulevikuväljavaated
Rekombinantsete valkude tootmist võib nüüd pidada küpseks teadusharuks. See on puhastamise ja analüüsi arvukate järkjärguliste täiustuste tulemus. Praegu peatatakse ravimite avastamise programme harva, kuna ei ole võimalik toota sihtvalku. Mitmete rekombinantsete ainete ekspressiooni, puhastamise ja analüüsi paralleelsed protsessid on nüüdseks hästi tuntud paljudes laborites üle maailma.
Valgukompleksid ja kasvav edu valmistamiselsolubiliseeritud membraanstruktuurid nõuavad rohkem muudatusi, et nõudlusega sammu pidada. Tõhusate lepinguliste uurimisorganisatsioonide tekkimine valkude regulaarsemaks tarnimiseks võimaldab teadusressursse nende uute väljakutsetega toimetulemiseks ümber jaotada.
Lisaks peaksid paralleelsed töövood võimaldama luua jälgitava aine täielikke teeke, et võimaldada uue sihtmärgi tuvastamist ja täiustatud sõeluuringut, koos traditsiooniliste väikesemolekuliliste ravimite avastamise projektidega.
