Gram-peitsi kasutatakse laialdaselt mikrobioloogias, kuna see on üks lihtsamaid viise bakterite eristamiseks nende rakuseina koostise alusel. Grami järgi võib kõik bakterid jagada grampositiivseteks (Gram (+)) ja gramnegatiivseteks (Gram (-)). Grami peitsimeetod töötati välja 1884. aastal ja pole sellest ajast alates populaarsust kaotanud, kuigi seda on mitu korda muudetud.
Rakuseina struktuur
Gramvärvimine näitab, kas bakter on grampositiivne või gramnegatiivne. Bakterite jagunemine grammideks (+) ja grammideks (-) toimub vastav alt nende rakuseina struktuurile.
Rakusein sisaldab kõige rohkem peptidoglükaani (mureiini) – kompleksset ainet, mis sisaldab peptapeptiidi ja glükaani. Glükaan koosneb vahelduvatest N-atsetüülglükoosamiini ja N-atsetüülmuraamhappe jääkidest, mis on omavahel seotud β-1 kaudu,4-glükosiidsidemed. Peptidoglükaan tagab raku kuju säilitamise, osmootse kaitse ja antigeensed funktsioonid.
Peamised erinevused grampositiivsete ja gramnegatiivsete bakterite vahel
Erinevatel bakteritel on erinev peptidoglükaanikihi paksus. Gram-positiivseteks klassifitseeritud bakterites on see vahemikus 15–80 nm, gramnegatiivsetes aga 2–8 nm. Samas on gramnegatiivsetel bakteritel peptidoglükaani kihi all eriline struktuur, mida grampositiivsetel bakteritel ei ole – periplasmaatiline ruum. See ruum on täidetud hüdrolüütiliste ensüümidega - β-laktamaas, ribonukleaas 1, fosfataas. Just need ensüümid vastutavad gramnegatiivsete bakterite resistentsuse eest paljude antibiootikumide suhtes.
Bakterite Gram(-) peptidoglükaanikiht on seotud lipopolüsahhariidiga, endotoksiini sisaldava antigeense struktuuriga. Gram(+) bakterites täidavad teikhoiinhapped sarnaseid funktsioone.
Gramnegatiivsetel bakteritel on täiendav struktuur – välismembraan.
Värvimismeetodi olemus
Enne värvimise alustamist valmistatakse uuritud bakteritest määrded. Selleks tilgutatakse vett klaasklaasile ja lisatakse sinna bakterisilmuse abil mikroorganismide kultuur. Seejärel, pärast vee täielikku kuivamist, määritakse määrdumine - klaasklaasi kantakse mitu korda üle põleti leegi. Gramivärvimine on efektiivsem kui elusate bakteritega värvimine – värvimolekulid seostuvad paremini surnud rakkudega.
Värvimine toimub mitmes etapis:
- Väikesed filterpaberi tükid asetatakse fikseeritud määrdumisele ja valatakse põhivärv – emajuurviolett või metüleensinine.
- 3-5 minuti pärast eemaldage värviline filterpaber ja täitke määrdumine 1 minutiks Lugoli lahusega. Sel juhul preparaat tumeneb.
- Lugoli lahus kurnatakse ja äigepreparaadi töödeldakse puhta etüülalkoholiga: preparaadile tilgutatakse paar tilka, kurnatakse 20 sekundi pärast. Protseduuri korratakse 2-3 korda.
- Loputage katseklaasi destilleeritud veega.
- Tootke lisavärvimine – lõpetage ettevalmistus fuksiiniga. 1-2 minuti pärast pestakse värv maha.
- Pärast vee kuivamist uurige määrdumist mikroskoobi all. Grampositiivsed bakterid on sinakasvioletsed, gramnegatiivsed aga roosad või punased.
Erinevate määrdumismustrite põhjused
Nagu ülalpool kirjeldatud, värvib bakterite grampositiivsed bakterid sinakasvioletseks, gramnegatiivsed aga punaseks või roosaks. Selle meetodiga bakterite erineva värvimise põhjuseks on see, et pärast emajuurvioletti lahustuva vormi sisenemist rakku läheb värvaine lahustumatuks joodivormiks. Bakterite töötlemisel etüülalkoholiga ekstraheeritakse lipiidid membraanist selle mittepolaarse lahusti toimel. Seejärel muutub membraan poorseks ega ole enam oluline takistus värvi leostumisel. Kuidpeptidoglükaan on vastupidavam mittepolaarsete lahustite, sealhulgas alkoholi suhtes. Just tema takistab värvaine väljapesemist, mistõttu paksu mureiinikihiga bakterid muutuvad sinakasvioletseks (grampositiivseks) ja pärast alkoholiga töötlemist ei muuda nad oma värvi.
Gramnegatiivsete bakterite õhuke mureiinikiht ei suuda värvainemolekule rakus hoida, mistõttu muutuvad need pärast alkoholi toimet värvituks – määrivad gramnegatiivseks.
Pärast määrdumist fuksiiniga jäävad Gram-värviga bakterid sinakasvioletseks, gramnegatiivsed aga roosakaspunaseks.
Gram(+) ja Gram(-) bakterite näited
Gramnegatiivsete bakterite hulka kuuluvad tsüanobakterid, väävlibakterid, rauabakterid, klamüüdia, riketsia, äädikhappebakterid, paljud metüülobakterid, tioonbakterid, arsenitobakterid, karboksübakterid.
Bifidobakterid, paljud veebakterid, streptokokid ja stafülokokid on grampositiivsed.
