Mis on DNA hübridisatsiooni aluseks? Kuigi kaheahelaline DNA järjestus on füsioloogilistes tingimustes üldiselt stabiilne, põhjustab nende tingimuste muutmine laboris (tavaliselt ümbritseva õhu temperatuuri tõstmisega) molekulide eraldumise üksikuteks ahelateks. Viimased täiendavad üksteist, kuid võivad täiendada ka teisi nende keskkonnas esinevaid järjestusi. Ümbritseva õhu temperatuuri alandamine võimaldab üheahelalistel molekulidel üksteisega lõõmuda või "hübridiseeruda". See on DNA hübridisatsioonimeetod.
Konseptsioon molekulaarbioloogia vaatenurgast
Teadlased, kes tegelevad nii DNA replikatsiooni kui ka DNA transkriptsiooniga RNA-ks, tuginevad nukleotiidide ristumisele ja molekulaarbioloogia tehnikatele. See hõlmab Southern ja Northern blot, polümeraasi ahelreaktsiooni (PCR) ja enamikku DNA-RNA hübridisatsiooni ja sekveneerimise lähenemisviise.
Rakendus
Hübridisatsioon on nukleotiidi peamine omadusjärjestused ja seda kasutatakse paljudes molekulaarbioloogia meetodites. Kahe liigi üldist geneetilist suhet saab määrata nende DNA segmentide hübridiseerimisega (DNA-DNA hübridisatsioon). Tihed alt seotud organismide järjestuste sarnasuste tõttu on selliste DNA hübriidide sulatamiseks vaja kõrgemat temperatuuri võrreldes kaugemate organismidega. DNA proovi päritolu määramiseks kasutatakse hübridisatsiooni, sealhulgas polümeraasi ahelreaktsiooni (PCR). Teise meetodi kohaselt hübridiseeritakse lühikesed DNA järjestused raku mRNA-ga, et tuvastada ekspresseeritud geene. Farmaatsiaettevõtted uurivad antisenss-RNA kasutamist soovimatu mRNA-ga seondumiseks, takistades ribosoomil mRNA-d valguks muutmast.
DNA-DNA hübridisatsioon viitab üldiselt molekulaarbioloogia tehnikale, mis mõõdab DNA järjestuste kogumite geneetilise sarnasuse astet. Seda kasutatakse tavaliselt kahe organismi vahelise geneetilise kauguse määramiseks. Seda on laialdaselt kasutatud fülogeneesis ja taksonoomias.
Metoodika
Ühe organismi DNA märgistati, seejärel segati märgistamata DNA-ga, mida sai sellega võrrelda. Segu inkubeeritakse, et lasta DNA ahelatel dissotsieeruda, ja seejärel jahutatakse, et moodustada regenereeritud hübriidne kaheahelaline DNA. Suure sarnasusastmega hübridiseeritud järjestused seonduvad tihedam alt ja nõuavad nende eraldamiseks rohkem energiat: st nad eralduvad, kui neid kuumutatakse kõrgemal temperatuuril.temperatuur kui erinevad järjestused, protsess on tuntud kui "DNA sulamine".
DNA sulamine
Hübridiseerunud DNA sulamisprofiili hinnates seotakse kaheahelaline DNA niinimetatud "kolonni" ja saadud segu kuumutatakse. Igas etapis kolonni pestakse ja sulavad DNA järjestused muutuvad üheahelaliseks ja pestakse kolonnist välja. Temperatuur, mille juures märgistatud DNA kolonnist väljub, peegeldab järjestuste sarnasust (ja isevoltiv muster toimib kontrollina). Need tulemused kombineeritakse organismide geneetilise sarnasuse määra määramiseks. Kaasaegse mikrobioloogia järgi on DNA hübridisatsioon võimatu ilma nendest asjadest aru saamata.
Kui sel viisil võrreldakse mitut ribonukleiinhappe (või desoksüribonukleiinhappe) liiki, võimaldavad sarnasusväärtused paigutada liigid fülogeneetilisesse puusse. Seetõttu on see üks võimalikest lähenemisviisidest molekulaarse süstemaatika läbiviimiseks. Selle tehnika pioneerid Charles Sibley ja John Ahlquist kasutasid DNA-DNA hübridisatsiooni, et uurida lindude (Sibley-Ahlquisti taksonoomia) ja primaatide fülogeneetilisi suhteid.
Tähtsus bioloogia jaoks
DNA-DNA hübridisatsioon on kuldstandard bakteriliikide eristamiseks, mille sarnasusväärtus on üle 70%, mis näitab, et võrreldavad tüved kuuluvad erinevatesse liikidesse. 2014. aastal pakuti bakteri alamliigi eraldamiseks 79% sarnasust.
Kriitikud väidavad, et see meetod on lähed alt seotud liikide võrdlemiseks ebatäpne, kuna kõik katsed mõõta erinevusi ortoloogiliste järjestuste vahel organismide vahel on hämmingus paraloogiliste vastete hübridiseerimisega organismi genoomis. DNA sekveneerimine ja arvutuslikud järjestuste võrdlused on praegu tavapäraselt kasutatav meetod geneetilise kauguse määramiseks, kuigi seda lähenemisviisi kasutatakse mikrobioloogias endiselt bakterite tuvastamiseks.
Praegune viis on läbi viia DNA-DNA hübridisatsioon silikoonis, kasutades täielikult või osaliselt sekveneeritud genoome. DSMZ poolt välja töötatud GGDC on kõige täpsem teadaolev tööriist DDH-sarnaste väärtuste arvutamiseks. Muude algoritmiliste täiustuste hulgas lahendab see paraloogsete järjestustega seotud probleemi, filtreerides need hoolik alt kahe genoomi järjestuse vastetest välja.
KALA meetod
Fluorestsents-in situ hübridisatsioon (FISH) on laboritehnika, mida kasutatakse DNA tuvastamiseks ja järjestamiseks, sageli konkreetses kromosoomis.
1969. aastal avaldasid Joseph Gall ja Mary Lou Pardu artikli, mis näitas, et ribosomaalse DNA järjestuse radioaktiivseid koopiaid saab kasutada komplementaarsete DNA järjestuste tuvastamiseks konnamuna tuumas. Alates nendest esialgsetest tähelepanekutest on paljud täiustused suurendanud mitmekülgsust japrotseduuri tundlikkust sel määral, et in situ hübridisatsiooni ("paigas", ladina k.) peetakse nüüdseks tsütogeneetika oluliseks vahendiks. (Nüüd kasutatakse terminit in situ ka kartsinoomi kasvu algfaasi tähistamiseks, kui patoloogilises protsessis osaleb ainult epiteelkude.)
Fluorestsentshübridisatsiooni järjestus
RNA sondid saab kavandada mis tahes geeni või geeni mis tahes järjestuse jaoks, et visualiseerida lncRNA ja miRNA mRNA kudedes ja rakkudes. FISH-i kasutatakse rakkude paljunemise tsükli uurimiseks, eriti tuuma interfaasi uurimiseks mis tahes kromosomaalsete kõrvalekallete korral. FISH võimaldab analüüsida suurt hulka arhiivijuhtumeid, tuvastatud kromosoomi on palju lihtsam tuvastada, luues tehiskromosoomialusega sondi, mis tõmbab ligi sarnaseid kromosoome.
Hübridisatsioonisignaalid iga sondi jaoks, kui tuvastatakse tuumaanomaalia: iga mRNA ja lncRNA tuvastamise sond koosneb 20 paarist oligonukleotiididest, iga paar katab 40–50 aluspaari suuruse ruumi. lk Sondid kasutavad mRNA tuvastamiseks patenteeritud keemiat.
Hübridiseerimine DNA-sondidega
Sondid tehakse sageli DNA fragmentidest, mis on inimese genoomi kujundamisel isoleeritud, puhastatud ja amplifitseeritud. Inimese genoomi suurus on otseselt sekveneeritava pikkusega võrreldes nii suur, et see tuleb jagadakillud. Lõppkokkuvõttes järjestati need fragmendid, lõigates iga fragmendi koopia veelgi väiksemateks ühikuteks, kasutades järjestusspetsiifilisi endonukleaase, et mõõta iga väikese fragmendi suurust, kasutades suuruseralduskromatograafiat, kasutades seda teavet, et teha kindlaks, kus suured fragmendid üksteisega kattuvad.
Elementide koos nende individuaalsete DNA järjestustega säilitamiseks lisati fragmendid pidev alt korduvate bakteripopulatsioonide süsteemi. Bakterite kloonseid populatsioone, kus iga populatsioon säilitab ühe kunstliku kromosoomi, säilitatakse erinevates laborites üle maailma. Kunstlikke kromosoome (BAC) saab kasvatada, ekstraheerida ja märgistada igas raamatukogu sisaldavas laboris. Genoomiraamatukogud on sageli nimetatud nende asutuste järgi, kus need välja töötati. Näiteks võib tuua RPCI-11 raamatukogu, mis sai nime Buffalos (New York, USA) asuva Roswelli vähiinstituudi järgi. Need fragmendid moodustavad umbes 100 tuhat aluspaari ja on enamiku FISH-sondide aluseks.
