Valguse neeldumine ja edasine taasemissioon anorgaanilise ja orgaanilise keskkonna poolt on fosforestsentsi või fluorestsentsi tulemus. Nähtuste erinevus seisneb valguse neeldumise ja voo emissiooni vahelise intervalli pikkuses. Fluorestsentsi korral toimuvad need protsessid peaaegu samaaegselt ja fosforestsentsi korral teatud viivitusega.
Ajalooline taust
1852. aastal kirjeldas Briti teadlane Stokes esimest korda fluorestsentsi. Ta võttis selle uue termini kasutusele oma katsete tulemusena fluoriidiga, mis kiirgas ultraviolettvalgusega kokkupuutel punast valgust. Stokes märkis huvitava nähtuse. Ta leidis, et fluorestsentsvalguse lainepikkus on alati pikem kui ergastava valguse lainepikkus.
Hpoteesi kinnitamiseks viidi 19. sajandil läbi palju katseid. Nad näitasid, et mitmesugused proovid fluorestseerivad ultraviolettvalgusega kokkupuutel. Materjalide hulka kuulusid muu hulgas kristallid, vaigud, mineraalid, klorofüll,meditsiinilised toorained, anorgaanilised ühendid, vitamiinid, õlid. Värvainete otsene kasutamine bioloogilises analüüsis algas alles 1930. aastal
Fluorestsentsmikroskoopia kirjeldus
Mõned 20. sajandi esimesel poolel uurimistöös kasutatud materjalid olid väga spetsiifilised. Tänu indikaatoritele, mida kontrastmeetoditega ei olnud võimalik saavutada, on fluorestsentsmikroskoopia meetodist saanud oluline tööriist nii biomeditsiinilistes kui ka bioloogilistes uuringutes. Saadud tulemused polnud materjaliteaduse jaoks väikese tähtsusega.
Millised on fluorestsentsmikroskoopia eelised? Uute materjalide abil sai võimalikuks väga spetsiifiliste rakkude ja submikroskoopiliste komponentide eraldamine. Fluorestsentsmikroskoop võimaldab tuvastada üksikuid molekule. Erinevad värvained võimaldavad teil korraga tuvastada mitu elementi. Kuigi seadmete ruumilist lahutusvõimet piirab difraktsioonipiir, mis omakorda sõltub proovi spetsiifilistest omadustest, on ka sellest tasemest madalamate molekulide tuvastamine täiesti võimalik. Erinevatel proovidel on pärast kiiritamist autofluorestsents. Seda nähtust kasutatakse laialdaselt petroloogias, botaanikas ja pooljuhtide tööstuses.
Funktsioonid
Loomsete kudede või patogeensete mikroorganismide uurimist raskendab sageli kas liiga nõrk või väga tugev mittespetsiifiline autofluorestsents. Kuid väärtus sisseuurimistöö omandab teatud lainepikkusel ergastatud ja vajaliku intensiivsusega valgusvoogu kiirgavate komponentide sisestamise materjali. Fluorokroomid toimivad värvainetena, mis on võimelised struktuuridele (nähtamatutele või nähtavatele) isekinni. Samal ajal eristab neid kõrge selektiivsus sihtmärkide ja kvantsaagise suhtes.
Fluorestsentsmikroskoopiat on laialdaselt kasutatud koos looduslike ja sünteetiliste värvainete tulekuga. Neil oli spetsiifiline emissiooni ja ergastuse intensiivsuse profiil ning need olid suunatud konkreetsetele bioloogilistele sihtmärkidele.
Üksikute molekulide identifitseerimine
Tihti saate idea altingimustes registreerida ühe elemendi sära. Selleks on muuhulgas vaja tagada piisav alt madal detektori müra ja optiline taust. Fluorestseiini molekul võib kiirata kuni 300 000 footoni enne hävimist fotovalgenduse tõttu. 20% kogumismäära ja protsessi efektiivsusega saab neid registreerida umbes 60 tuhande väärtuses
Fluorestsentsmikroskoopia, mis põhineb laviini fotodioodidel või elektronide paljunemisel, võimaldas teadlastel jälgida üksikute molekulide käitumist sekundite ja mõnel juhul minutite jooksul.
Raskused
Põhiprobleem on optilise tausta mürasummutus. Kuna paljudel filtrite ja läätsede valmistamisel kasutatud materjalidel on mõningane autofluorestsents, keskendusid teadlaste jõupingutused algstaadiumis nende väljastamisele.madala fluorestsentsiga komponendid. Hilisemad katsed viisid aga uute järeldusteni. Eelkõige on leitud, et täielikul sisepeegeldusel põhinev fluorestsentsmikroskoopia annab madala tausta ja suure ergastusvalguse väljundi.
Mehhanism
Täielikul sisepeegeldusel põhineva fluorestsentsmikroskoopia põhimõte on kasutada kiiresti lagunevat või mittelevivat lainet. See tekib erinevate murdumisnäitajatega kandjate liideses. Sel juhul läbib valguskiir prisma. Sellel on kõrge murdumisnäitaja.
Prisma on vesilahuse või madala parameetriga klaasi kõrval. Kui valguskiir on suunatud sellele kriitilisest suurema nurga all, peegeldub kiir liidesest täielikult. See nähtus omakorda põhjustab mitteleviva laine. Teisisõnu tekib elektromagnetväli, mis tungib madalama murdumisnäitajaga keskkonda vähem kui 200 nanomeetri kaugusel.
Mitteleviva laine puhul on valguse intensiivsus fluorofooride ergutamiseks täiesti piisav. Erakordselt madala sügavuse tõttu jääb selle maht aga väga väikeseks. Tulemuseks on madala tasemega taust.
Muudatus
Täielikul sisepeegeldusel põhinevat fluorestsentsmikroskoopiat saab teostada epi-valgustusega. Selleks on vaja suurendatud numbrilise avaga objektiive (vähem alt 1,4, kuid on soovitav, et see ulatuks 1,45–1,6), samuti aparaadi osaliselt valgustatud välja. Viimane saavutatakse väikese täpiga. Suurema ühtluse tagamiseks kasutatakse õhukest rõngast, mille kaudu osa voolust blokeeritakse. Kriitilise nurga saavutamiseks, mille järel toimub täielik peegeldus, on vajalik läätsede ja mikroskoobi katteklaasi keelekümbluskeskkonna kõrge murdumise tase.
