Erinev alt eukarüootidest ei ole bakteritel moodustunud tuum, kuid nende DNA ei ole rakus laiali, vaid on koondunud kompaktsesse struktuuri, mida nimetatakse nukleoidiks. Funktsionaalses mõttes on see tuumaaparaadi funktsionaalne analoog.
Mis on nukleoid
Bakteri nukleoid on nende rakkude piirkond, mis sisaldab struktureeritud geneetilist materjali. Erinev alt eukarüootsest tuumast ei ole see membraaniga eraldatud ülejäänud raku sisust ja sellel ei ole püsivat kuju. Sellest hoolimata on bakterite geneetiline aparaat tsütoplasmast selgelt eraldatud.
Termina ise tähendab "tuumalaadne" või "tuumapiirkond". Selle struktuuri avastas esmakordselt 1890. aastal zooloog Otto Buchli, kuid selle erinevused eukarüootide geneetilisest aparaadist tuvastati juba 1950. aastate alguses tänu elektronmikroskoopia tehnoloogiale. Nimetus "nukleoid" vastab mõistele "bakteriaalne kromosoom", kui viimane sisaldub rakus ühes eksemplaris.
Nukleoid ei sisalda plasmiide, mison bakteri genoomi ekstrakromosomaalsed elemendid.
Bakteriaalse nukleoidi omadused
Tavaliselt hõivab nukleoid bakteriraku keskosa ja on orienteeritud piki selle telge. Selle kompaktse moodustise maht ei ületa 0,5 mikronit3 ja molekulmass varieerub vahemikus 1×109 kuni 3×109 d altonit. Teatud punktides on nukleoid seotud rakumembraaniga.
Bakteri nukleoid sisaldab kolme komponenti:
- DNA.
- Struktuursed ja reguleerivad valgud.
- RNA.
DNA-l on kromosomaalne struktuur, mis erineb eukarüootsest. Kõige sagedamini sisaldab bakteriaalne nukleoid ühte kromosoomi või mitut selle koopiat (aktiivse kasvu korral ulatub nende arv 8 või enamani). See indikaator varieerub sõltuv alt mikroorganismi elutsükli tüübist ja etapist. Mõnel bakteril on mitu kromosoomi, millel on erinevad geenikomplektid.
Nukleoidse DNA keskel on üsna tihed alt pakitud. See tsoon on ribosoomidele, replikatsiooni- ja transkriptsiooniensüümidele kättesaamatu. Vastupidi, nukleoidi perifeerse piirkonna desoksüribonukleiinsed ahelad on otseses kontaktis tsütoplasmaga ja esindavad bakteri genoomi aktiivseid piirkondi.
Valgukomponendi kogus bakteriaalses nukleoidis ei ületa 10%, mis on umbes 5 korda väiksem kui eukarüootses kromatiinis. Enamik valke on seotud DNA-ga ja osalevad selle struktureerimises. RNA on toodebakterigeenide transkriptsioon, mis viiakse läbi nukleoidi perifeerias.
Bakterite geneetiline aparaat on dünaamiline moodustis, mis on võimeline muutma oma kuju ja struktuurset konformatsiooni. Sellel puuduvad eukarüootse raku tuumale iseloomulikud nukleoolid ja mitootiline aparaat.
Bakteriaalne kromosoom
Enamasti on bakteriaalsete nukleoidide kromosoomidel suletud ring. Lineaarsed kromosoomid on palju vähem levinud. Igal juhul koosnevad need struktuurid ühest DNA molekulist, mis sisaldab bakterite ellujäämiseks vajalikke geene.
Kromosomaalne DNA valmib ülikeerdunud silmuste kujul. Silmuste arv kromosoomi kohta varieerub vahemikus 12 kuni 80. Iga kromosoom on täisväärtuslik replikon, kuna kahekordistamisel kopeeritakse DNA täielikult. See protsess algab alati replikatsiooni alguspunktist (OriC), mis on kinnitatud plasmamembraanile.
DNA molekuli kogupikkus kromosoomis on mitu suurusjärku suurem kui bakteri suurus, mistõttu on vaja see pakendada, kuid säilitades funktsionaalse aktiivsuse.
Eukarüootses kromatiinis täidavad neid ülesandeid peamised valgud – histoonid. Bakteriaalne nukleoid sisaldab DNA-d siduvaid valke, mis vastutavad geneetilise materjali struktuurse korralduse eest ning mõjutavad ka geeniekspressiooni ja DNA replikatsiooni.
Nukleoididega seotud valgud hõlmavad järgmist:
- histoonitaolised valgud HU, H-NS, FIS ja IHF;
- topoisomeraasid;
- SMC perekonna valgud.
Viimasel kahel rühmal on suurim mõju geneetilise materjali ülikerimisele.
Kromosomaalse DNA negatiivsed laengud neutraliseerivad polüamiinid ja magneesiumioonid.
Nukleoidi bioloogiline roll
Esiteks on nukleoid vajalik bakteritele päriliku informatsiooni talletamiseks ja edastamiseks, samuti selle rakendamiseks rakusünteesi tasandil. Teisisõnu, selle moodustise bioloogiline roll on sama, mis DNA-l.
Teised bakteriaalsed nukleoidfunktsioonid on järgmised:
- geneetilise materjali lokaliseerimine ja tihendamine;
- funktsionaalne DNA pakend;
- ainevahetuse reguleerimine.
DNA struktureerimine mitte ainult ei võimalda molekulil mikroskoopilisse rakku mahtuda, vaid loob ka tingimused replikatsiooni- ja transkriptsiooniprotsesside normaalseks kulgemiseks.
Nukleoidi molekulaarse korralduse omadused loovad tingimused raku metabolismi kontrollimiseks, muutes DNA konformatsiooni. Reguleerimine toimub kromosoomi teatud osade väljaviimisel tsütoplasmasse, mis muudab need transkriptsiooniensüümide jaoks kättesaadavaks, või vastupidi, tõmmates need sisse.
Tuvastamismeetodid
Bakterites nukleoidi visuaalseks tuvastamiseks on kolm võimalust:
- valgusmikroskoopia;
- faasikontrastmikroskoopia;
- elektronmikroskoopia.
Sõltub meetodistpreparaadi valmistamisel ja uurimismeetodil võib nukleoid välja näha erinev.
Valgusmikroskoopia
Nukleoidi tuvastamiseks valgusmikroskoobiga värvitakse bakterid eelnev alt nii, et nukleoidil oleks ülejäänud rakusisu värvusest erinev värv, vastasel juhul pole see struktuur nähtav. Samuti on kohustuslik bakterite fikseerimine klaasklaasil (sel juhul mikroorganismid surevad).
Läbi valgusmikroskoobi läätse näeb nukleoid välja nagu selgete piiridega oakujuline moodustis, mis hõivab raku keskosa.
Värvimismeetodid
Enamasti kasutatakse nukleoidi valgusmikroskoopias visualiseerimiseks järgmisi bakterite värvimismeetodeid:
- Romanovsky-Giemsa järgi;
- Felgeni meetod.
Romanovsky-Giemsa järgi värvimisel kinnitatakse bakterid eelnev alt metüülalkoholiga alusklaasile ja seejärel immutatakse 10-20 minutiks värvainega, mis on saadud taevasinise, eoniini ja metüleensinise võrdsest segust., lahustatud metanoolis. Selle tulemusena muutub nukleoid lillaks ja tsütoplasma kahvaturoosa. Enne mikroskoopiat kuivatatakse plekk, pestakse objektiklaasi destillaadiga ja kuivatatakse.
Feulgeni meetod kasutab nõrga happe hüdrolüüsi. Selle tulemusena läheb vabanev desoksüriboos aldehüüdi vormi ja interakteerub Schiffi reagendi fuksia-väävelhappega. Selle tulemusena muutub nukleoid punaseks ja tsütoplasma siniseks.
Faasikontrastmikroskoopia
Faaskontrastmikroskoopil onsuurem eraldusvõime kui valgus. See meetod ei nõua preparaadi fikseerimist ja värvimist – vaatlus toimub elusbakterite suhtes. Sellistes rakkudes olev nukleoid näeb tumeda tsütoplasma taustal välja heleda ovaalse alana. Tõhusama meetodi saab teha fluorestseeruvate värvainetega.
Nukleoidide tuvastamine elektronmikroskoobiga
Preparaadi ettevalmistamiseks nukleoidide uurimiseks elektronmikroskoobi all on kaks võimalust:
- üliõhuke lõige;
- Lõika külmunud bakterid.
Bakteri üliõhukese lõigu elektronmikrofotodel näeb nukleoid välja õhukestest filamentidest koosneva tiheda võrgustruktuurina, mis näeb välja ümbritsevast tsütoplasmast heledam.
Külmutatud bakteri lõigul pärast immuunvärvimist näeb nukleoid välja nagu korallitaoline struktuur, millel on tihe südamik ja õhukesed eendid, mis tungivad tsütoplasmasse.
Elektroonilistel fotodel hõivab bakterite nukleoid kõige sagedamini raku keskosa ja selle maht on väiksem kui elusrakul. Selle põhjuseks on kokkupuude preparaadi fikseerimiseks kasutatud kemikaalidega.
