Molekulaarbioloogilised uurimismeetodid mängivad kaasaegses meditsiinis, kohtuekspertiisi ja bioloogias suurt rolli. Tänu edusammudele DNA ja RNA uurimisel on inimesel võimalik uurida organismi genoomi, määrata haiguse tekitajat, ära tunda soovitud nukleiinhapet hapete segus jne.
Molekulaarbioloogilised uurimismeetodid. Mis see on?
70ndatel ja 80ndatel õnnestus teadlastel esimest korda inimese genoom dešifreerida. See sündmus andis tõuke geenitehnoloogia ja molekulaarbioloogia arengule. DNA ja RNA omaduste uurimine on viinud selleni, et nüüd on võimalik neid nukleiinhappeid kasutada haiguse diagnoosimiseks ja geenide uurimiseks.
DNA ja RNA hankimine
Molekulaarbioloogilise diagnostika meetodid nõuavad lähtematerjali olemasolu: sagedamini on selleks nukleiinhapped. Nende ainete eraldamiseks elusorganismide rakkudest on mitu võimalust. Igal neist on oma eelised ja puudused ning see on vajalikarvestage puhaste nukleiinhapete eraldamise meetodi valimisel.
1. DNA saamine Marmuri järgi. Meetod seisneb ainete segu töötlemises alkoholiga, mille tulemusena sadestub puhas DNA. Selle meetodi puuduseks on agressiivsete ainete kasutamine: fenool ja kloroform.
2. DNA eraldamine Boomi järgi. Peamine siin kasutatav aine on guanidiintiotsüanaat (GuSCN). See aitab kaasa desoksüribonukleiinhappe sadestamisele spetsiaalsetel substraatidel, kust seda saab seejärel spetsiaalse puhvri abil koguda. GuSCN on aga PTC inhibiitor ja isegi väike osa sellest, mis satub sadestunud DNA-sse, võib mõjutada polümeraasi ahelreaktsiooni kulgu, mis mängib olulist rolli töös nukleiinhapetega.
3. Lisandite settimine. Meetod erineb eelmistest selle poolest, et sadestuvad mitte desoksüribonukleiinhappe molekulid, vaid lisandid. Selleks kasutatakse ioonivahetiid. Puuduseks on see, et kõik ained ei saa sadestuda.
4. Massiline sõeluuring. Seda meetodit kasutatakse juhtudel, kui pole vaja täpset teavet DNA molekuli koostise kohta, kuid on vaja hankida mõningaid statistilisi andmeid. Seda seletatakse asjaoluga, et nukleiinhappe struktuur võib detergentidega, eriti leelistega töötlemisel kahjustuda.
Uurimismeetodite klassifikatsioon
Kõik molekulaarbioloogilise uurimismeetodid on jagatud kolme suurde rühma:
1. Amplifitseerimine (paljude ensüümide kasutamine). Siinviitab PCR-polümeraasi ahelreaktsioonile, mis mängib paljudes diagnostikameetodites suurt rolli.
2. Mittevõimendus. See meetodite rühm on otseselt seotud nukleiinhapete segude toimimisega. Näited on 3 blot, in situ hübridisatsioon jne.
3. Meetodid, mis põhinevad konkreetse sondi DNA või RNA-ga seonduva sondi molekuli signaali äratundmisel. Näiteks on hübriidhõivesüsteem (hc2).
Ensüümid, mida saab kasutada molekulaarbioloogia uurimismeetodites
Paljud molekulaardiagnostika meetodid hõlmavad paljude ensüümide kasutamist. Allpool on kõige sagedamini kasutatavad:
1. Restriktsiooniensüüm – "lõikab" DNA molekuli vajalikeks osadeks.
2. DNA polümeraas – sünteesib kaheahelalise desoksüribonukleiinhappe molekuli.
3. Pöördtranskriptaas (revertaas) – kasutatakse DNA sünteesimiseks RNA matriitsil.
4. DNA ligaas – vastutab nukleotiidide vaheliste fosfodiestersidemete moodustumise eest.
5. Eksonukleaas – eemaldab desoksüribonukleiinhappemolekuli terminaalsetest osadest nukleotiidid.
PCR on peamine DNA amplifitseerimise meetod
Polümeraasi ahelreaktsiooni (PCR) kasutatakse tänapäevases molekulaarbioloogias aktiivselt. See on meetod, mille abil saab ühest DNA molekulist saada tohutul hulgal koopiaid (molekule amplifitseeritakse).
PCR-i põhifunktsioonid:
- diagnostikahaigused;
- DNA segmentide, geenide kloonimine.
Polümeraasi ahelreaktsiooni läbiviimiseks on vaja järgmisi elemente: esialgne DNA molekul, termostabiilne DNA polümeraas (Taq või Pfu), desoksüribonukleotiidfosfaadid (lämmastikualuste allikad), praimerid (2 praimerit 1 DNA molekuli kohta) ja puhversüsteem ise, milles kõik reaktsioonid on võimalikud.
PCR koosneb kolmest etapist: denatureerimine, praimeri anniilimine ja elongatsioon.
1. Denatureerimine. Temperatuuril 94-95 kraadi Celsiuse järgi katkevad DNA kahe ahela vahelised vesiniksidemed ja selle tulemusena saame kaks üheahelalist molekuli.
2. Praimeri lõõmutamine. Temperatuuril 50–60 kraadi Celsiuse järgi kinnituvad praimerid üheahelaliste nukleiinhappemolekulide otstele komplementaarsuse tüübi järgi.
3. Pikendamine. Temperatuuril 72 kraadi süntees toimub desoksüribonukleiinhappe kaheahelaliste tütarmolekulide süntees.
DNA sekveneerimine
Molekulaarbioloogilised uurimismeetodid nõuavad sageli desoksüribonukleiinhappemolekuli nukleotiidjärjestuse tundmist. Geneetilise koodi määramiseks viiakse läbi sekveneerimine. Tuleviku molekulaardiagnostika põhineb inimeste sekveneerimisest saadud teadmistel.
Eristatakse järgmisi järjestustüüpe:
- Maxam-Gilberti järjestus;
- Sangeri järjestus;
- pürosekveneerimine;
- nanoporejärjestamine.
